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这份His标签蛋白亲和层析介质的答卷,得分美丽

 

 
固定化金属离子亲和介质

His标签由于其分子量小、与金属离子结合能力强以及在变性条件下也可保持与介质结合的特性,已成为最常用的亲和标签固定化金属离子亲和层析(IMAC)原理为:暴露在蛋白质表面的某些氨基酸侧链(主要是His,及少量的Cys和Trp),可与过渡金属离子之间发生特定的可逆性相互作用,从而实现对蛋白的分离纯化。金属离子通常为Zn2+、Ni2+、Cu2+或Co2+,如今用Ni2+固定化金属离子亲和层析已成为纯化组氨酸标签蛋白的标准方法。蛋白质/肽与固定化金属离子相互作用的强度取决于氨基酸侧链的类型、数量和空间分布,以及所使用的金属离子的性质。

 

 

星谱生物His标签产品

 

星谱产品

我们提供不同规格的Ni-NTA Starose 6 Fast Flow预装产品,包括1 mL预装柱、5 mL预装柱、10~110 mL XPXK预装柱。

 

产品特点

Ni-NTA Starose 6 Fast Flow介质基质为高交联度琼脂糖,介质偶联NTA配基后螯合Ni2+。Ni2+具有6个螯合位点,其中4个位点用于与NTA配基结合,剩余2个位点用于结合His-tag蛋白。

 

介质特性

 快流速

 高载量

 高纯度

 使用过程中镍离子脱落极低

 易于放大

 

应用案例

使用星谱生物Ni-NTA Starose 6 Fast Flow进行His-tag蛋白纯化,获得了以下结果:

 Ni2+脱落量低

 纯化重复性好

 纯化不同长度标签效果均较好

 纯化不同分子量蛋白效果均较好

 纯化规模易放大(1 mL、5 mL和300 mL)

 

 
 
低Ni2+脱落
 

1:20 mM HAc-NaHAc,0.5 M NaCl,pH 4.0  

2:20 mM PB,0.5 M NaCl,pH 6.0  

3:20 mM PB,0.5 M NaCl,pH 7.5  

4:50 mM Tris,0.5 M NaCl,pH 8.5

5:50 mM PB,0.5 M NaCl,pH 7.5

6:20 mM Tris,0.5 M NaCl,pH 8.5

7:50 mM Tris ,0.5 M NaCl,8 M Urea ,pH8.0

8:His-tag Pro-1(Mr~25 000) E. coli 纯化后

 

分析:分别用7种缓冲液淋洗Ni-NTA Starose 6 Fast Flow介质10 CV,测定介质中Ni2+含量变化情况,缓冲液pH分别为4.0、6.0、7.5和8.5时,Ni2+脱落量均小于5%,并且随着缓冲液浓度增大,Ni2+脱落量无明显增加。在8 M尿素溶液淋洗下,Ni2+脱落量小于5%,表明介质可耐受8 M尿素。纯化过程中的低Ni2+脱落,最大限度地减少了潜在问题,如Ni2+诱导的目标蛋白的寡聚化和沉淀,以及介质载量的损失。

 

 
 
(His)

6

-tag 蛋白6次重复纯化
 
 

图1. 6次重复纯化SDS-PAGE电泳检测

 

分析:使用相同样品,在相同工艺下进行6次纯化实验,无需对介质再生、清洗或Ni2+补充,具有极佳的纯度和回收率重现性。

 

 
 
(His)

10

-tag 蛋白纯化
 

图2.(His)10-tag 蛋白纯化SDS-PAGE电泳检测

 

分析:(His)10-tag蛋白经Ni-NTA Starose 6 Fast Flow一步纯化得到较高纯度目标蛋白。

 

 
 
 不同分子量
(His)

6

-tag
蛋白纯化 
 
 

图3. 不同分子量(His)6-tag纯化SDS-PAGE电泳检测

分析:4种不同分子量His-tag蛋白以不同浓度咪唑结合缓冲液纯化,经Ni-NTA Starose 6 Fast Flow一步纯化均能得到较高纯度目标蛋白。

 

 
 
 
(His)

6

-tag
蛋白纯化放大 
 

图4. (His)6-tag蛋白纯化放大SDS-PAGE电泳检测

分析:将His-tag Pro-1蛋白纯化规模从1 mL预装柱放大到5mL预装柱,再进一步放大到300 mL层析柱,得到目的蛋白纯度分别为95.1%、94.5%和96.8%,收率分别为94.5%、95.2%和97.2%。相较于1 mL预柱和5 mL预装柱,使用300 mL色谱柱对该蛋白进行纯化,纯度和收率均略有上升,表明Ni-NTA Starose 6 Fast Flow可以在不影响纯度和收率的前提下实现对His-tag标签蛋白纯化工艺的放大。

 

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